XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN East Asian Passiflora virus GÂY BỆNH TRÊN CHANH DÂY (Passiflora edulis Sims) BẰNG REAL-TIME PCR

East Asian Passiflora virus (EAPV) là một trong ba loại virus gây bệnh hóa bần vỏ trái ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng chanh dây. Để kiểm soát hiệu quả bệnh này cần phát hiện sớm và chính xác sự hiện diện của virus trên cây. Nghiên cứu này thiết lập quy trình phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (real-time polymerase chain reaction, RT-PCR) phát hiện virus từ mô lá chanh dây nhiễm bệnh. Phân đoạn gen mã hóa protein vỏ của virus được khuếch đại bằng phản ứng RT-PCR, tách dòng và kiểm chứng bằng phân tích trình tự trước khi thiết lập phản ứng RT-PCR. Ngưỡng phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phản ứng khuếch đại cũng được xác định. Kết quả cho thấy phản ứng RT-PCR đã khuếch đại được phân đoạn gen (188 bp) tương đồng trên mức 90% so với các trình tự gen đã công bố của virus EAPV. Phản ứng RT-PCR có phương trình đường chuẩn dạng y = –3,3346x + 40,924 với hệ số tương quan R² = 0,9903. Ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của phản ứng đạt mức tương ứng 100 và 1.000 bản sao/µL. Các mẫu chanh dây thu thập bị nhiễm virus với số lượng dao động từ 10⁵ đến 10⁷ copies/µL.

East Asian Passiflora virus (EAPV) is one of three viruses that cause woodiness disease which seriously affects the yield and quality of passion fruit. It is necessary to detect early and accurately the presence of viruses on passion fruit for effective control. This study establishes a RT-PCR procedure for virus detection using RNA extracted from infected passion fruit leaf tissue. The viral coat protein-coding gene segment was amplified by RT-PCR, cloned, and sequenced prior to the establishment of the RT-PCR. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the amplification reaction were also determined. The results showed that the RT-PCR successfully amplified a gene segment of ~188 bp which is 86.17-93.09% homologous to the published EAPV gene sequences. The RT-PCR presents a calibration curve y = -3.3346x 40,924, the correlation coefficient R2 = 0.9903. The response thresholds for detection and quantification were 100 and 1000 copies/µL, respectively. The passion fruit samples in the collection were infected with the number of viruses from 105-107 copies/µL as diagnosed by the established method.