NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEN KHÁNG NOURSEOTHRICIN LÀM MARKER CHỌN LỌC DÙNG CHO CHUYỂN GEN VÀO NẤM ƯA NHIỆT Myceliophthora thermophila NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Myceliophthora thermophila là một loài nấm ưa nhiệt có khả săng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme bền nhiệt. Một số enzyme do loài nấm này sinh ra như cellulase, xylanase và phytase có tiềm năng sử dụng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Phát triển công cụ phục vụ cải biến di truyền nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme ở M. thermophila giữ một vai trò quan trọng. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên gen kháng nourseothricin được sử dụng thành công làm marker chọn lọc để chuyển gen vào chủng nấm M. thermophila DSM 1799 nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chủng M. thermophila DSM 1799 được đánh giá về mức độ mẫn cảm với kháng sinh nourseothricin. Kết quả cho thấy chủng nấm này bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ nourseothricin khá thấp (50 μg/ml). Kết quả nghiên cứu cũng chứng minh gen huỳnh quang GFP được chuyển thành công vào hệ gen của chủng M. thermophila DSM 1799 khi sử dụng marker chọn lọc là gen kháng nourseothricin. Sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu GFP-F/GFP-R đã xác nhận sự có mặt của gen GFP trong hệ gen của các thể chuyển gen thu được. Đặc biệt khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, các thể chuyển gen đã có khả năng sinh tổng hợp protein GFP để phát màu huỳnh quang xanh trong hệ sợi và bào tử nấm.

Myceliophthora thermophila is a thermophilic fungus capable of biosynthesis of thermally stable enzymes. Some enzymes produced by this fungus such as cellulase, xylanase and phytase have the potential to be used as animal feed supplements. Developing tools for genetic manipulation in order to increase the ability of enzyme biosynthesis plays an important role in M. thermophila. In this study, for the first time, the nourseothricin resistance gene was successfully employed as a selection marker for gene transfer into M. thermophila DSM 1799 via Agrobacterium tumefaciens. The M. thermophila DSM 1799 strain was examined for its sensitivity towards nourseothricin. Results showed that this strain was completely inhibited at a quite low concentration of nourseothricin (50 μg/ml). The results also demonstrated that the GFP gene was successfully transferred to the genome of M. thermophila DSM 1799 using the nourseothricin resistance marker. The PCR-based analysis with the specific primer pair GFP-F/GFP-R has confirmed the presence of the GFP gene in the genome of all tested transgenic strains. Especially, when observed under a fluorescence microscope, these transgenic strains were able to produce the GFP protein, which emits the green fluorescent signal in fungal mycelium and spores.