NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO LAN Mokara QUA TRUNG GIAN VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Tại Việt Nam, Mokara là một trong hai loài lan cắt cành đang được ưa chuộng trên thị trường hiện nay. Việc xây dựng thành công quy trình chuyển gen vào lan này có thể được ứng dụng để nâng cao chất lượng hoa lan. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang vector pCAMBIA1301 được sử dụng để chuyển gen mục tiêu vào PLBs của lan Mokara. Các yếu tố như môi trường kích thích sự tái sinh PLB từ mẫu lá, môi trường kích thích sự tăng sinh của PLBs, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone, nồng độ kháng sinh khử khuẩn và nồng độ kháng sinh sàng lọc PLBs chuyển gen đã được khảo sát. Hiệu quả chuyển gen được xác định dựa trên tỷ lệ mẫu dương tính GUS trên tổng số mẫu được lây nhiễm. Kết quả cho thấy môi trường Murashige & Skoog (MS) bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 2,0 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh PLBs từ mẫu lá cao nhất (91,67%) sau 15 tuần nuôi cấy. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L kết hợp 1,0 mg/L NAA thích hợp cho sự tăng sinh PLBs, trọng lượng PLBs đạt 25,70 g sau 8 tuần nuôi cấy. Hiệu quả chuyển gen cao nhất đạt được khi có sự hiện diện của 50 µM acetosyringone trong quá trình chuyển gen với thời gian đồng nuôi cấy là 2 ngày. Kháng sinh cefotaxime ở nồng độ từ 300 mg/L đến 500 mg/L có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy. Kháng sinh hygromycin ở nồng độ 10 mg/L thích hợp cho giai đoạn sàng lọc PLBs chuyển gen.

Mokara spp. is currently one of the most important orchid genera in Vietnam and it is favorite as a cut flower orchid as well as a potted plant. Therefore, developing an efficient genetic transformation protocol for this orchid is essential for improving its qualities. This study focused on examining the influence of the concentration of acetosyringone on transformation efficiency and evaluating suitable concentration of anitibiotics for bacteria elimination after co-culture period and selection of putative transformants using disarmed Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harbouring vector pCAMBIA1301. Other factors such as proliferation of PLBs from leaf explants and multiplication of PLBs were also studied using Murashige & Skoog (MS) media supplemented with different concentrations of plant growth hormones BA and NAA. The results showed that MS media supplemented with 0.5 mg/L BA and 2 mg/L NAA induced highest PLB proliferation rate (91.67%) from leaf explants after 15 weeks of culture. MS media supplemented with 0.5 mg/L BA and 1 mg/L NAA is suitable for PLB multiplication and the fresh weight of PLBs was 25.70 g after 8 weeks of culture. The transformation efficiency was defined as the number of PLBs expressing GUS by the total number of inoculated PLBs. And the highest efficiency was obtained when 50 µM acetosyringone was added to the bacterial suspension and co-culturing media with 2 days of the co-culture period. Concentration of cefotaxime from 300 mg/L to 500 mg/L was able to eliminate bacteria on PLB after co-culture period and hygromycin at 10 mg/L was effective for selection of putative transformants.